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            BIM试剂盒教您如何选择正确的反转录方法


            发布日期:[2017-11-17] 共阅[541]次

               逆转录PCR(RT-PCR)在实验室中经常被用于检测和量化样本中的RNA表达。实验的*步是通过逆转录(RT)将不稳定的RNA转化为互补的DNA(cDNA)。实际上,RT是许多用于研究RNA的分子生物学技术的*步,因为将不稳定的RNA转换为更稳定的DNA会使分析更容易、更可靠。对于RT-PCR,有一步法和两步法。
                       pcr-method

             

               在一步法RT-PCR中,RT反应和PCR扩增是在同一管中进行。将RNA模板添加到试管中,加有两?#32622;?逆转录酶和DNA聚合酶),以及完成反应的所有必须组分。逆转录酶产生cDNA产物,?#32531;?#36870;转录酶和cDNA变性,DNA聚合酶扩增cDNA。在一步法中,RT反应由基因特异性引物启动。因此,只有?#34892;?#36259;的区域被反向转录,?#32531;?#36827;行扩增。


               在两步法RT-qPCR中,RT反应与PCR扩增单独进行。首先,RNA添加到反应混合物中,混合物包括逆转录酶和oligo-dTs (结合mRNA的poly-A尾巴)或随机六聚体(或两者都有),合成cDNA。下一步,从管子中取出少量cDNA,置于一个新管中,作为PCR的模板与基因特定的引物一起混合。因为RT反应采用随机启动或由oligo-dTs进行启动,总RNA或总mRNA在RT步骤中被转录。尽管这两种方法都能得到zui终的结果,但是每种方法都有优缺点。选择哪种方法取决于各种因素。如下总结它们的优缺点。


            一步法RT-PCR:
            优点: 只需一步,反应发生在单管中,速?#32570;?#20004;步法更快,而且需要较少的准备和操作时间。
            处理大量样品时?#23376;?#25805;作,减少污染的机会。
            整个cDNA样品都被扩增,灵敏度更高。
            缺点: 同一样本只有有限数量的目的基因被扩增。另一个挑战是组分的兼容性,因为一步法需要转录和扩增之间的平衡。
            适用性:当时间对于实验很重要时,一般采用一步法。例如,迅速的一步法是RNA病毒检测的好方法,结果可以很快得到。也适用于高通量分析。 由于该方法采用基因特异性引物,所以通常是分析低表达水平基因的较好选择。此外,一步法是非常的,需要测量表达水平上的细微差异时这是一种常用的方法。


            两步法RT-PCR:
            优点: 可以分析同一样本的多个目标。
            逆转录步骤将样本中所有的RNA转换为cDNA,可以储存cDNA用于后续实验,检测大量基因。
            能够分别优化RT和PCR步骤,可以更好地控制实验过程。
            因为只有少量的转录材料用于PCR,任何可能从RNA分离到RT反应的?#31181;?#21058;(如乙醇、苯酚或胍盐)都被稀释了。
            缺点:它更耗费时间,且带?#27425;?#26579;的可能性更高。RT步骤转录所有的RNA以相同的效率,选择这种方法时,应?#27599;?#34385;到启动会影响qPCR的结果。例如,以oligo-dTs 和随机六聚体启动反应可能会带来不同的结果。因此,对于每个RT反应应该使用相同的条件。
            适用性:选择两步方法的zui常见原因是对同一样本的多个目标进行分析。第二,当RNA的存储是个问题时,zui好是进行两步RT-PCR,因为cDNA在-20°C是稳定的。此外,当起始材料有限时,使用两步RT-PCR ,通常会有更高的cDNA产量。

                       

             

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