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            上海劲马手把手教您做免疫共沉淀实验


            发布日期:[2018-02-06] 共阅[560]次

               免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋?#23383;?#30456;互作用的经典方法。是确定两种蛋?#23383;?#22312;完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
            注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶?#31181;?#21058;。
            一.工作液配制:
            配制100ml的modified RIPA buffe:
            1、称取790mg的Tris-Base,加到75ml去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用 HCl调节PH值到7.4;
            2、加10ml 10%的NP-40;
            3、加2.5ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清;
            4、加1ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2~8℃ 保存;
            5、理论上,蛋白酶和磷酸酯酶?#31181;?#21058;应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮?#32622;?#32957;, 胃蛋白酶?#31181;?#21058;各100μl;PMSF,Na3VO4,NaF各500μl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使?#20204;?#29616;加,其他?#31181;?#21058;成分可以在水溶液中稳定5天。
            二.各种成分在工作液中的终浓度:
            Tris-HCl:50mM,pH7.4
            NP-40:1%
            去氧胆酸钠:0.25%
            NaCl:150mM
            EDTA:1mM
            PMSF:1mM
            抑蛋白酶肽,亮?#32622;?#32957;,胃蛋白酶?#31181;?#21058;:各1μg/ml
            Na3VO4:1mM
            NaF:1mM
            三.实验步骤:
            1、转染后24~48h可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲?#28023;?#21547;蛋白酶?#31181;?#21058;),冰上裂解30min,细胞裂解液于4℃,zui大转速离心30min 后取上清;
            2、取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解?#28023;?℃缓慢摇晃孵育过夜;
            3、取10μl protein A琼脂糖珠,用适量裂解缓冲?#21512;?次,每次3000rpm,离心3min;
            4、将预处理过的10μl protein A琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃ 缓慢摇晃孵育 2~4h,使抗体与protein A琼脂糖珠?#21058;?br />5、免疫沉淀反应后,在4℃以3000rpm 速度离心3min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲?#21512;?~4次;zui后加入15μl的2×SDS上样缓冲?#28023;?#27832;水煮5分钟;
            6、SDS-PAGE,Western blotting或质谱仪分析。
            四.通过免疫共沉淀确定结?#31995;?#30333;:
            1、用磷酸?#20301;?#20914;?#21512;?0块10cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC 裂解缓冲液中。
            2、将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃ 以zui大速度离心15min。
            3、收集上清(约30ml)并加入30μg的?#23454;?#25239;体,4℃摇动免疫沉淀物1h。
            4、加入0.9ml的蛋?#23383;蔄-Sepharose 悬?#28023;?℃摇动免疫沉淀物30min。
            5、用含900mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。zui后,用NETN洗一次。
            6、吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4min。
            7、将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE梯度胶中,在10mA的恒定电流下电泳过夜。
            8、通过考马斯蓝染色观察蛋?#23383;?#27891;带。
            9、从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml50% 乙腈洗两次,每次3min。
            10、用胰蛋白酶消化胶中的蛋?#23383;剩?#20877;将肽电洗脱。
            11、通过窄孔?#21512;?#33394;谱分离肽。将收集的肽在ABI477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
            五.注意事项:
            1、细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋?#23383;剩?#34507;?#23383;?#30456;互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能?#37238;?#27987;度的变性剂(0.2% SDS),细胞裂解液中要加各?#32622;敢种?#21058;,如商品化的cocktailer。
            2、使用明?#36820;?#25239;体,可以将几种抗体共同使用。
            3、使用对照抗体:
            ① 单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗
            ② 兔多克隆抗体:正常兔IgG
            4、在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:
            ① 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生
            ② 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀
            ③ 确定蛋?#20934;?#30340;相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋?#23383;实?#23450;位来确定。

                                           

             

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