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            劲马解析酶切不动或切不完全有哪些原因?


            发布日期:[2018-03-07] 共阅[726]次

               如果遇到酶切不动或切不完全,该怎么办?要回答这个问题常常需要了解酶活性单位是如何确定,我们经常遇到这样的问题:1个单位的酶能在60分钟内切1ug的DNA,为什么我们的DNA那么少切那么长时间也不能切开或切完全? 今天劲马解析酶切不动或切不完全有哪些原因?
            1、酶是否有活性:
               酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug λDNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板,也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的,虽然识别位点相同,但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用说明书上认定的酶活确定的方式,通常需要用λDNA做模板来判定。如果酶同时对甲基化敏感,还需要用Dcm-, Dam-的DNA。不排除由于运输或分装不当导致酶活性下降,这种情况是很少发生。
            2、模板性质是否清楚:
               如果DNA的类型变了,所需要的酶量也不同。酶切效果与DNA的性质(线状,超螺旋状)、位点数目、位点左右的序?#23567;?#30002;基化程?#21462;?#32431;度等有很大的关系。对超螺旋状DNA完全酶切所需要的酶量要比线状的高好几倍,同时需要提高酶的用量(10U/ug)和延长?#20174;?#26102;间等措施。还有一个问题是有些时候DNA是从别人那里得到的,背景不清楚也造成困惑。
            3、模板纯度是否够:
               模板制备方式?#19981;?#24433;响DNA的质量,若在制备过程中使用到yi醇,氯fang,苯酚,SDS,EDTA等,如果这些物质残留在zui终的DNA模板中,那么都会不同程度影响酶的活性。Miniprep时如果用试剂盒抽提,需要考虑的污染问题是变性剂和yi醇;如果是手工制备的,氯fang,yi醇,苯酚及细胞内其他杂质都会不同程度的干扰酶活性。
            4、甲基化程度对酶的活性是否有影响:
               细菌中主要有Dcm和Dam两种甲基化方式,在植物和动物细胞中主要是CG位被甲基化。仔细?#32431;词?#29992;的 酶对甲基化的敏感情况,或许能找到酶切效率低或根本不能酶切的根源。
            5、?#20174;?#26465;件是否合适:
               对照说明书,检查使用的温度是否正确,是否需要添加BSA, 是否使用正?#36820;?#32531;冲溶液。由于缓冲液中基本都含有DTT,反复冻融会使模板使DTT降解。注意有些研究人?#33519;玝uffer长时间放在4度或室温,这是很不规范的行为。
            6、酶稀释和添加方式是否正确:
               一般要求在zui后加酶,但是同时做多个相同?#20174;?#30340;时候,zui后加酶有可能不是很方便。通常是将缓冲、酶和适量的水配制成一个混合物,?#32531;?#20998;装,zui后加模板。需要提醒的是混合物(Master Mix)中由于没有底物的存在,离子强度也不对,酶可能会受到损伤。这种提前混?#31995;?#20570;法没有问题,只是动作要快一些,没有分装前的Mix,要求放在冰里,尽快使用。

               如果您在做ELISA试剂盒实验中遇到不明白的问题,不妨本公司业务员,将为您安排技术专员进行指导!真?#31995;?#27426;迎更多的科?#20449;笥延?#36291;加入我们!

             

             

            主营:ELISA检测试剂盒;免疫组化试剂盒,胎牛血清;酶联免疫试剂盒,进口抗体,生物试剂 公司地址:上海市闵行区莘庄工业园区金都路3688号E幢101-106室 ?#25910;?#32534;码:201100 
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