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            实验高手在线解答:免疫沉淀(IP)的常见问题


            发布日期:[2018-04-27] 共阅[573]次

            1. 用于一般免染的抗体是否都可以用作免疫沉淀实验? 
            答:抗体的性质对免疫沉淀实验影响很大。抗体不同,和抗原以及Protein G或Protein A的结合能力也就不同。所以一般免染能结合的抗体未必能用于IP反应。 一般来说,多抗是沉淀反应zuihao的选择。另外,纯化的单抗、腹水和杂交瘤上清液也可用于免疫沉淀。
            2. 为什么溶解抗原的缓冲液中要加入一定量的蛋白酶?#31181;?#21058;? 
            答:从活性细胞裂解出来的样品中,往往含有一定量的蛋白酶。为防止预检测蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每?#31181;?#21058;,并且在低温下进行实验。
            3. 溶解抗原的缓冲液的配制需要注意什么? 
            答:多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强表面活性剂的缓冲?#28023;?#23613;管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱表面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合。
            4. 免疫沉淀实验应如何把握抗体和缓冲液的比例? 
            答:每次沉淀实验之前,考虑抗体/缓冲液的比例十分重要。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清;缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。具体比例视具体情况而定。
            5. 免疫沉淀应该如?#38395;?#21046;细胞裂解?#28023;?nbsp;
            答:?#23454;?#30340;细胞裂解液的选择取决于所要研究蛋白的特性。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和;DOC(sodium de-oxycholate),SDS是离?#26377;?#30340;强活性剂。所以裂解液的配制时所用去污剂的种类和浓度以及?#38395;?#24230;等条件需实验者进行优化。注意如果忘记加TritonX-100,只加DOC或SDS,可能使抗体完全失去活性。
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